最適化されたNurr1アゴニストが疾患を引き起こす

Nature Communications volume 14、記事番号: 4283 (2023) この記事を引用

3438 アクセス

46 オルトメトリック

メトリクスの詳細

核内受容体 Nurr1 は、中脳ドーパミンニューロンの発生と維持の両方に重要であり、パーキンソン病 (PD) の有望な分子標的です。我々は以前、同一の化学骨格である4-アミノ-7-クロロキノリン（4A7C）を共有する3つのNurr1アゴニスト（アモジアキン、クロロキン、グラフェニン）を同定しており、構造活性相関が示唆されている。本明細書では、570を超える4A7C誘導体が生成され、特徴付けられた系統的な医薬化学検索を報告する。複数の化合物が Nurr1 の転写活性を増強し、in vitro で強力な神経保護効果を示す、最適化された脳浸透アゴニスト 4A7C-301 の同定につながります。さらに、4A7C-301 は、MPTP 誘発性 PD 雄マウスモデルの中脳ドーパミンニューロンを保護し、ジスキネジー様の行動を起こすことなく、運動嗅覚障害と非運動嗅覚障害の両方を改善します。さらに、4A7C-301 は、AAV2 媒介α-シヌクレイン過剰発現雄マウスモデルにおいて、神経病理学的異常を大幅に改善し、運動機能障害および嗅覚障害を改善します。 4A7C-301 のこれらの疾患修飾特性は、PD 患者の治療のためのこの化合物または類似化合物の臨床評価を正当化する可能性があります。

パーキンソン病 (PD) は 65 歳以上の人口の 2 ～ 3% が罹患しており、アルツハイマー病に次いで 2 番目に多い神経変性疾患です 1,2,3。黒質における中脳ドーパミンニューロン（mDAN）の選択的変性およびレビー小体における神経毒性α-シヌクレイン（αSyn）の蓄積および凝集は、PDの顕著な病理学的特徴である。 PD の発現は、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、神経炎症、タンパク質分解/オートファジーの調節不全など、複数の相互作用経路を介した遺伝的要因と環境的要因の複合作用によって引き起こされると考えられています3、4、5、6、7。現在、ドーパミン (DA) 補充療法 (L-DOPA など) が最も標準的な治療法です。 PD 患者の生活の質は大幅に改善されますが、ジスキネジアなどの許容できない副作用が発生しない治療範囲と効果の程度は時間の経過とともに減少し 8,9、疾患の進行を止めたり遅らせたりできる治療法はありません。したがって、PD10、11に対する新規の疾患修飾治療を開発するという大きなニーズが満たされていません。

過去数十年にわたり、mDAN の転写調節カスケードが包括的に研究されてきました 12。 2 つの主要な mDAN 発達経路 (つまり、ソニックヘッジホッグ-FoxA2 および Wnt1-Lmx1A) が収束して Nurr113、14、15 を誘導し、Nurr1 が mDAN のマスター制御因子であることが強調されています。実際、Nurr1 ノックアウト (KO) および条件付き KO マウスの研究では、Nurr1 が発生 16 だけでなく成体 mDAN の維持にも不可欠であることが実証されました 17。さらに、Nurr1 は、神経毒性のある炎症誘発性遺伝子の発現を抑制することにより、mDAN を神経炎症誘発性死から保護することが示されました 4。さらに、Nurr1 発現は、高齢および散発性 PD 患者の両方の脳で大幅に減少していることが報告されています 18、19、20。

Nurr1 は核内受容体 NR4A サブファミリーに属しており、その転写機能が合成リガンドおよび/または内因性リガンドによって調節され得ることが示唆されています 21。さらに、Nurr1 は、細胞状況に応じて (例えば、それぞれ mDANs16 およびミクログリア 4 において) 転写活性化因子およびリプレッサーとして機能することができます。 Nurr1 が PD22 の疾患修飾治療の分子標的である可能性があるかどうかの検討を開始するために、我々はハイスループットアッセイシステムを確立し、事前に US-FDA 承認薬のライブラリーをスクリーニングしました。我々は、リガンド結合ドメイン (LBD) への直接結合を通じて Nurr1 の転写活性を有意に増強する 3 つの薬剤、すなわちアモジアキン (AQ)、クロロキン (CQ)、およびグラフェニンを同定しました23。 3 つの薬剤はすべて、同一の化学的足場を共有していました。 4-アミノ-7-クロロキノリン (4A7C) は、この 4A7C モチーフが構造活性相関 (SAR) を表しており、これを使用して、SAR ベースの医薬品を通じてより高い効力とより少ない副作用を備えたより優れた 4A7C 誘導体を同定するために使用できる可能性があるという仮説を立てました。化学24．この仮説に沿って、Munoz-Tello らの最近の研究は次のとおりです。 25およびWillemsら。２６、２７は、ＡＱおよびＣＱおよびそれらの誘導体がＮｕｒｒ１アゴニストとして機能し得ることを示した。ウィレムスら。また、26 人らは、4A7C ファーマコフォアの 7-クロロ基または 4-アミノ基の除去により活性が失われることを報告しており、4A7C が強力な Nurr1 アゴニストの設計に有効なファーマコフォアであるという我々の仮説をさらに裏付けています。この目的に向けて、CQ は比較的安全であり、マラリアや自己免疫疾患などのヒトの病気の治療に今でも広く使用されているため、CQ を出発化合物として使用して系統的な医薬化学の取り組みを実施しました 28。私たちは、生化学、分子、および細胞アッセイを使用して複数（>570）の 4A7C 誘導体を特性評価し、PD の in vitro および in vivo モデルの両方で確実に高い効力を示し、メカニズムに基づいた神経保護効果を提供する最終候補 4A7C-301 を特定しました。 PDの環境（ミトコンドリア複合体I阻害剤1-メチル-4-フェニルピリジニウム（MPP+））と遺伝（αSyn）危険因子モデルの両方を別々に使用した。 L-DOPA や CQ とは異なり、4A7C-301 は、ジスキネジー様の行動やオートファジー阻害などの副作用を伴うことなく、運動機能障害と非運動機能障害の両方を大幅に改善しました。我々のデータは、最適化されたNurr1アゴニストが散発性PDと家族性PDの両方に対して疾患修飾治療を提供できる可能性があるという原理の証明を示している。

morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>

50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>